Proteomica. profil proteic in prognostic si diagnostic

PROTEOMICA. PROFIL PROTEIC IN PROGNOSTIC SI DIAGNOSTIC

Proteomica se ocupa cu studiul proteinelor din proteom (corespondentul genomului uman la nivel de proteine):

• Catalogarea tuturor proteinelor exprimate de un organism in intreaga sa existenta si in toate conditiile
• Determinarea structurii proteinelor
• Masurarea expresiei proteinelor
• Determinarea compozitiei proteice a organitelor celulare
• Analiza modificarilor post-translationale ale proteinelor
• Analiza interactiunilor proteina-proteina
• Analiza interactiunii proteinelor cu un anumit ligand (medicament)

Toate aceste actiuni servesc scopului de a identifica proteinele si a determina structura si functionalitatea acestora.

Aplicatiile Proteomicii in Medicina

IDENTIFICAREA DE MARKERI MOLECULARI IN DIVERSE BOLI

• in scop diagnostic
• pentru investigarea profilului pacientului

IDENTIFICAREA DE TINTE TERAPEUTICE

• Descoperirea de tinte terapeutice
• Validarea lor
• Trialuri clinice
• Monitorizarea eficientei strategiei terapeutice alese

Particularitatile Proteomicii

• Luand in considerare faptul ca o gena poate genera mai multe proteine, daca la nivelul genomului uman sunt aproximativ 30 000 de gene, numarul proteinelor din proteom este probabil de 10 ori mai mare.
• Proteinele exprimate in organism variaza cu varsta, starea de sanatate a organismului, tipul de tesut si cu factorii de mediu
• Proteomica implica o gama mai larga de metode si tehnici decat genomica

Avantajele Proteomicii

• Se axeaza pe proteine care sunt adevaratii agenti activi in celula/tesut/organism in timp ce analiza expresiei ARNm nu reflecta totdeauna nivelul real al expresiei proteinei
• Folosesc probe biologice precum ser, LCR, urina care nu pot fi folosite in analiza expresiei ARNm
• Analizeaza si modificarile proteinelor (ex. cele post-translationale) care nu pot fi remarcate prin analiza secventei de ADN
• Permite localizarea unei anumite proteine

Fluxul de lucru in Proteomica

• Pregatirea probelor pornind de la diverse probe biologice: fluide biologice, tesuturi (biopsii), celule, componente subcelulare
• Separarea proteinelor
• Detectia proteinelor
• Identificarea proteinelor
• Validarea si analiza functionala

Separarea proteinelor

• Electroforeza bidimensionala (2D SDS-PAGE)

• MALDI - TOF MS (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation - Time-of-Flight / Mass Spectrometry)

• Cromatografie

Electroforeza bidimensionala pe gel de poliacrilamida (2D PAGE)

Proteinele sunt separate intr-o dimensiune pe baza masei moleculare. Ulterior gelul este rotit cu un unghi de 90O pentru separarea proteinelor pe baza sarcinii (pH-ului isoelectric). Dupa separare gelul este colorat pentru vizualizarea spoturilor corespunzatoare proteinelor. 

Gel Electroforeza in doua dimensiuni

Avantaje:

• Permite analiza sute de proteine in acelasi timp (pana la 10000 de spoturi pe un gel, dar necesita fractionare prealabila)
• Se pot cuantifica proteinele
• Metoda este reproductibila
• Se pot izola din gel spoturile de interes
• Pot identifica si modificarile translationale ale proteinelor (pe baza pI sau a masei moleculare)

Dezavantaje:

• Este laborioasa
• Performanta scazuta in analiza proteinelor foarte mari sau foarte mici, a proteinelor cu abundenta mica, a proteinelor membranare
• Este dificil de interpretat chiar si cu software specializat
• Este limitata din punct de vedere al metodei de colorare

Metodele care folosesc spectrometria de masa masoara raportul dintre masa/sarcina electrica  difera in functie de componentele folosite astfel:

Sursa de ioni

• ESI electrospray poate fi cuplat cu electroforeza capilara, LC si fragmentare MS/MS pentru mai multe informatii (secventa AA din polipeptide)
• MALDI -extrage ioni de pe suprafata probelor si este folosit la determinarea masei peptidelor

Analizorul de masa

• Ion trap capteaza ionii in acord cu raportul masa/sarcina electrica si este cuplat cu ESI
• Time of flight (TOF)- masoara timpul in care ionii accelerati ajung pe detector in acord cu raportul masa/sarcina electrica si este folosit cu MALDI

Detectorul de ioni

• Unitate de achizitie a datelor cu software dedicat pentru a genera fingerprintul de  masa al proteinei (PMF) si de a identifica proteina prin comparare cu baza de date.

MALDI - TOF/ MS (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation - Time of Flight / Mass Spectrometry).

Proteinele sunt incorporate in cristale de molecule care adsorb radiatia UV (matrice). In acest proces, moleculele acide care adsorb radiatia UV transfera protoni proteinelor => proteine incarcate pozitiv. Matricea este iradiata cu o unda laser UV. Moleculele proteice excitate M+ trec printr-un tub de acceleratie, cationul cel mai mic fiind cel cel mai rapid, si ajung la detector; astfel se poate calcula timpul de zbor (time of flight - TOF) in acord cu raportul masa/sarcina electrica (M/S- Mass Spectrometry).

Utilitatea tehnicii MALDI-TOF MS

MALDI-TOF MS:

• Determinarea masei moleculare a proteinei
• Separarea amestecurilor proteice
• Determinarea puritatii proteinelor, utilizand cantitati de ordinul fM (10-15)
• In cazul in care secventa AA este cunoscuta (ex. prin analizarea secventei ADNc), iar proteina este purificata, se poate compara masa moleculara a proteinei obtinuta prin MALDI-TOF MS cu masa moleculara estimata prin analizarea secventei ADNc. Daca cele 2 mase moleculare sunt egale structura primara a proteinei este corecta. Valori diferite sunt sugestive pentru existenta unor modificari posttranslationale (ex. fosforilare, glicozilare) sau mutatii. Prin scindarea proteinei in peptide si compararea masei moleculare a peptidelor cu cea estimata prin analiza secventei ADNc se pot localiza situsurile corespunzatoare modificarilor postranslationale, mutatiilor, actiunii proteazelor etc.

SELDI-TOF
 (surface enhanced lasser desorbtion ionization)

• Chipurile au imobilizati diferiti liganzi care leaga specific proteinele din proba
• Proteinele nelegate sunt spalate si indepartate
• Spoturile sunt ionizate producandu-se un spectru MS-TOF

Purificarea complexelor proteice prin tehnica cromatografica

Celulele care contin proteina marcata sunt trecute prin coloana cromatografica pe care este fixat anticorpul specific proteinei de interes. Proteina marcata se va lega de anticorpul imobilizat pe coloana cromatografica, iar proteinele care interactioneaza cu aceasta vor fi retinute, de asemenea, pe coloana.