Tehnica electroforezei

Tehnica electroforezei

Cormay gel protein 100

Kit de diagnostic pentru electroforeza in gel de agaroza a proteinelor serice

Kit de diagnostic pentru electroforeza in gel de agaroza Cormay gel protein 100 este destinat separarii proteinelor serice , permitand obtinerea a 6 fractiuni

albumine

alpha-1 globuline

alpha-2 globuline

beta-1 globuline

beta-2 globuline

gamma-globuline

Principiul metodei Electroforeza proteinelor este o metoda de rutina in laboratoarele clinice, ca test de screening pentru ser.

Este bazata pe migrarea in camp electric continuu a proteinelor serice, migrare diferentiata in functie de masa moleculara si de sarcina electrica, si realizata pe un mediu de sustinere adecvat. Proteinele astfel separate sunt fixate cu ajutorul unui amestec de acid si alcool si colorate . Astfel colorate, fractiunile elctroforetice ale serului pot fi evaluate vizual ( electroforegrama) sau prin densitometrie, pentru a obtine cuantificari relative ale fiecarei zone individuale si interpretate patternurile normale sau anormale.

Se poate realiza o electroforegrama a fiecarei migrari. O electroforegrama normala are urmatorul aspect:

Continutul trusei

Gel de agaroza (placi cu agaroza)

Tampon TRIS-BARBITAL ( concentrat)

Solutie de colorare AMIDOBLACK ( concentrat)

Solutie de decolorare ( concentrat)

Blotters

Templates pentru aplicarea probei

Pastrarea se face la temperatura camerei, in pozitie orizontala ( cu gelul in sus), bine inchise. N u se congeleaza.

Pregatirea reactivilor

Tamponul: 1 flacon de tampon concentrat Tris-barbital se dilueaza la 10 litri de apa distilata ( sau 10 ml la 1000 ml). Stabilitate; 1 luna la temperatura camerei.

Solutia de colorare : 1 flacon Amidoblack concentrat se dilueaza cu 300 ml de apa distilata. Solutia diluata este stabila pana la expirarea termenului inscreis pe flacon.

Solutia de decolorare: 1 flacon solutie concentrata se dilueaza la 10 l cu apa distilata (sau 10 ml la 1000 ml). Stabilitate; 1 luna la temperatura camerei.

Solutia de fixare Se amesteca:

- 135 ml etanol 96% + 30 ml acid acetic glacial+ 135 ml apa distilata, sau

- 135 ml etanol 96% + 37.5 ml acid acetic glacial+ 127.5 ml apa distilata.

Solutia fixatoare trebuie preparata cu cel putin 15 minute inainte de folosire. Stabilitate: 3 luni de la preparare, in flacon inchis ermetic. Cu 300 ml de solutie pot fi fixate 5 placute cu gel.

Pot fi folosite si alte concentratii de acid sau/si alcool, dar cantitatea de apa distilata se modifica, astfel incat compozitia solutiei finale sa fie aceeasi .

Echipamentul necesar:

Echipamentul pentru electroforeza

Echipament general de laborator ( pipete, varfuri)

Procedura  

1. se toarna 150 ml ( Cormay CU-1 , Cormay S20) sau 45 ml ( Beckman) tampon diluat in fiecare parte a camerei.
2. Se scoate gelul din pachet fara a atinge suprafata si se pune pe o foaie de hartie sau blotter.Pentru a se evita uscarea si legat de problemele analitice, se scoate folia protectoare a gelului numai atunci cand echipamentul este pregatit si  serurile sunt diluate.
3. se foloseste blotterul pentru a usca aria unde se vor pune probele. Blotterul ud se indeparteza imediat.
4. Se pune template probe pe gel ( cele doua slots marginale vor fi conectate cu cele doua semne de orientare de npe placa) Se apasa cu degetul de-a lungul template , pentru a-l fixa pe gel. Trebuie sa dere bine la gel!
5. Se pipeteaza 5 ml de ser diluat in fiecare fanta ( taietura) si selasa 5 minute de la pipetarea ultimei probe
6. se indeparteaza excesul de ser cu blotterul.
7. Se scoate template
8. se curbeaza placa de agaroza si se pune pe suport cu fata in sus si probele spre catod ( -)
9. Se inchide camera de migrare cu capacul
10. Se executa migrarea ( electroforeza propriu-zisa) timp de 20 minute la 100V ( Cormay CU, Cormay S20) sau 15 minute ( beckmann)
11. Dupa migrare, se scot placile se se scufunda in solutia de fixare timp de 15 minute, in pozitie vertcala
12. se usuca gelul sub curent de aer cald sau la termostat la temperaturi de pana la 80 ^O C, pana cand sunt complet uscate.
13. Se introduc placile in solutia de colorare timp de 10 minute, apoi se decoloreaza in 2-3 bai succesive de solutie de decolorare.
14. Se clateste gelul cu apa distilata si se usuca  sub curent de aer cald sau la termostat la temperaturi de pana la 80 ^O C.
15. daca este necesar, se sterge dosul placii cu o hartie umeda
16. interpretarea poate fi facuta vizual sau cu un densitometru.