Sistemul oab

SISTEMUL OAB

ISTORIC

1900-1901 descoperit de Karl Landsteiner, care, punand in contact diverse esantioane de seruri umane , cu diverse esantioane de eritrocite, observa ca unele probe erau agglutinate, altele nu.Pe aceasta baza descrie 3 grupe sanguine pe care le numeste O,A,B.

1902 Decastello si Sturli descrie al patrulea grup, pe care-l numeste AB.

1907 Ianschi descrie cele 4 grupe sanguine pe care le noteaza : I, II, III, IV.

1911 von Dungern si Hirzfeld observa ca nu toate eritrocitele A dau reactii de aglutinare de aceeasi intensitate cu serul anti-A. Se descopera astfel subgrupele A1 si A2.

Importanta grupelor sanguine OAB

-inh transfuzie, in transplanturi,

-in studiul bolii hemolitice a nou nascutului

-in medicina legala, antropologie, genetica

Antigenele sistemului OAB

Caractere permanente, transmise comform legilor mendeliene.

Apar in primele saptamani de viata embrionara(a 4-a, a-5-a) cu apogen in dezvoltare in saptamanile 5-14, iar in saptamana a 20-a se ajunge la distributia definitive a antigenelor OAB in organism.Pe eritrocit apar in stadiul de proeritroblast.

Raspandirea antigenelor de grup OAB in natura.

1.-la om : sunt de 2 feluri :

a) pe celule : eritrocite, leucocite, trombocite, celulele tuturor tesuturilor,cu exceptia celulelor hepatice,Malpighi, tesutului conjunctiv si a celulei nervoase.

Natura antigenelor este glicolipidica,alcoolsolubile.Se evidentiaza prin reactie de aglutinare.De aceea se numesc aglutinogene.

b) Solubile in umori(slab specifice de grup) : saliva, lacrimi, lapte, sudoare, sperma, lichid amniotic, urina, suc gastric.Natura este glicoproteica,hidrosolubile , rezistente la fierbere.Evidentiere prin reactia de hemaglutinare.

Prezenta sau absenta substantelor specifice de grup in secretii este determinata de gena secretorie dominanta Se(SeSe, Sese)=status secretor (80% indivizi) si absenta lor de gena se-se(nesecretor 20%) si a genelor Hh,Se,ABH.

Importanta deosebita a compatibilitatii OAB in transplant

2.-la microorganisme : pneumococ tip XIV

3.-pe tesuturi animale : bovidee si porcine :substante A si H

cal, iepure : substante B

4.-substante comerciale : peptona(like A), substanta Witebsky.

Antigene si anticorpi.

Clasificarea grupelor sanguine din sistemul OAB se bazeaza pe prezenta sau absenta pe eritrocite a unuia sau ambelor antigene A sau B.

Eritrocitele de grup O nu au nici antigenul A si nici B.

Eritrocitele de grup B=antigenul B

Eritrocitele de grup A=antigenul A

Eritrocitele de grup AB= antigenul AB.

In sistemul OAB, sangele uman poseda si anticorpi (aglutinine) antieritrocitari : anti-A (alfa), anti -B(beta). In mod natural niciodata nu se gasesc la acelasi individ antigenul(aglutinogenul) si anticorpul (aglutinina) omolog.

Grup sanguin Antigene eritrocitare Anticorpi serici

O(alfa,beta) - antiA,antiB(alfa,beta)

A(beta) A anti-B(beta)

B(alfa) B anti-A(alfa)

AB(0) A B -

Pe baza acestor date , Landsteiner a enuntat cele doua legi de baza ale sistemului OAB:

1.In sangele aceluiasi individ nu pot coexista antigenul si anticorpul omolog.

2.Absenta unuia din cele doua aglutinogene implica prezenta aglutininei corespunzatoare.

Structura biochimica : antigenele A,B reprezinta etapa finala a glicozilarii numeroaselor lanturi zaharidice legate de proteinele sau lipidele din structura membranei eritrocitare.

Antigenele A si B sunt produsul enzimelor specifice ( glicoziltransferazele) A si B.Acestea sunt structuri specifice proteice rezultate din exprimarea genelor A si B cu sediul pe cromozonul 9.

Antigenul H (prezent pe eritrocitele O) este un antigen precursor produs sub actiunea genei H(din sistemul Hh Sese) prin intermediul enzimei alfa-2-fucoziltransferaza.

Subgrupele antigenelor A si B

Acestea sunt transmise genetic de la o generatie la alta

-1911 von Dungern diferentiaza un antigen A puternic (A1, A tare) si un antigen A slab (A2).

La grupele A si AB se identifica antigene si mai slabe decat A2 :Aint A3, Am, Ax, Aend, Ael, Afinn.

Subgrupele antigenului B -mai putin frecvente B3,Bx, Bm,Bel.

Antigenul H : schimbarea fundamentala si precursoare pentru antigenele A si sau B.Este determinat de gena H . Alela ei, gena h, in stare hemozigota (hh) determina fenomenul Bombay: aceste eritrocite nu poseda nici antigenul H ,nici A,nici B(deci nu poate fi aglutinat nici cu serul a-H,nici a-A,nicia-B), dar in serintalnim anticorpi antiH,antiA si anti B.

Frecventa : doar vreo 30 cazuri citate in literatura.

Importanta: poate fi transfuzat doar cu sange de fenotip Bombay.

Eritrocitele de grup O: contin substanta H in cantitate foarte mare (99.99).

Anticorpii anti-A si anti-B.

Dupa modul de aparitie sunt doua tipuri :

a) Anticorpi de tip natural ,de tip IgM sau IgA

-molecula mare

-produc aglutinarea imediata a eritrocitelor purtatoare de antigen A/B

-se numesc anticorpi « regulari » deoarece apar imediat dupa nastere (uneori si in viata intrauterina).

Sunt raspuns la stimuli antigenici din mediul inconjurator, identici sau analogi sb. De grup sanguin de pe bacterii, plante, flora intestinala.

Tipul molecular al anticorpilor ABO

1.Grup O : anticorpi anti A : amestec IgG si Ig M.

2.Grup B: amestec de IgM+IgG+IgA.

Distributia anticorpilor antiA si antiB in organism in lichidele biologice :

-in saliva,in special la personae O

in lapte mai mult de tip IgA decat IgM.

-in lichidul de ascita

-in lichidele flictenice

-in secretia cervicala.

Variatia valorica a anticorpilor ABO naturali:

-in primele 3 luni de viata : anticorpi de origine materna, in special IgG

-intre lunile 3-6 incepe sinteza anticorpilor proprii(IgM,IgM+IgG la grup O),atingand limite normale la varsta de 10 ani.

-dupa 10 ani incep sa se diminueze treptat, in special IgM,in raport cu varsta ,pe cand IgG ramane prezentpana la varsta inaintata.

b)Anticorpi imuni A/B.

-molecula mica de tip IgG,provoaca aglutinarea eritrocitelor intr-un mediu macromolecular sau a eritrocitelor tratate cu enzime (papaina,bromelina,ficina).

Apar prin aloimunizare de sarcina,transfuzii incompatibile sau prin heteroimunizare(infectare de substante,vaccinuri ce contin substante de grup A,B sau like A,B).

CARACTERELE ANTICORPILOR anti A si anti-B

CARACTERUL ANTICORPI NATURALI ANTIC. IMUNI

(completi) (incompleti)

Tipul de imunoglobulina IgM, IgA IgG

Temperatura de reactie +4 +22*C 37*C

Fixatori de complement da nu

Inactivare la 37*C,70*C

sau neutralizare cu sb spec da nu

de grup

Eritrocite utilizate omologe normale tratate cu enzime

VARIATIA ANTICORPILOR NATURALI antiA si antiB in unele situatii

a)Ttruri mici sau absenta de anticorpi: copii sub un an, batrani,boala Hodgkin

mielom multiplu, agamaglobulinemie, LLC

b)La persoanele de subgrup A2/A2B, poate exista un anticorp 'natural', 'iregular'antiA1.

Subgrupele A si AB sunt aproximativ 12.Cele mai importante sunt A2 si A2B care pot avea un anticorp natural antiA1 in ser.

SUBGRUP A FRECVENTA Antic. REGULARI Antic.IREGULARI

A1 80% anti-B -

A2 20% anti-B A1 in 2% cazuri

A1B 80% - -

A2B 20% - antiA1 in 25% cazuri

GENETICA GRUPELOR SANGUINE ABO

Transmiterea genetica conform cu regulilor lui Mendel

Celulele reproductive(spermatozoidul si ovulul) contin numai cromozomi singulari, care dupa fertilizare se recombina si se reformeaza perechi in embrionul viu.

Printre caracterele mostenite exista si gene pt specificitatea de grup sanguin ABO.Se mostenesc 4 gene alele : A1,A2, B, H, ce se exclud in timpul meiozei(pe cromozomul 9)

Genotip : genele mostenite de la fiecare parinte, prezente pe cromozomi.

Fenotip : efectul observabil al genelor mostenite : grupul sanguin.

In sistemul OAB, nu intotdeauna genotipul este identic cu fenotipul,genele A si B avand expresie dominanta fata de gena O,care este gena muta.

GENOTIP FENOTIP(grup sanguin)

AA A

AO A

BB B

BO B

AB AB (heterozigote)

OO O (homozigote)

FENOTIPURI CURENTE IN SISTEMUL OAB- subgrupe A

Antigenul A: fenotip A1 si A2 determinat de antiA, care aglutineaza toate eritrocitele de grup A si o alta diviziune a acestuia care aglutineaza 20% din ele(A2).

Consecinta: sase fenotipuri curente in sistemul OAB : A1, A2, A1B, A2B, O, B.

FENOTIP GENOTIPURI posibile

A1 A1O; A1A1;A1A2

A2 A2O, A2A2

O OO

B BB, BO

A1B A1B

A2B A2B

Arborele genealogic familial OAB

Genotip AO BO Parinti

Genotip AB AO OO BO Descendenti

Fenotip AB A O B

ENZIMELE SISTEMULUI OAB

Antigenele OAB nu sunt produsele directe ale genelor.Genele codifica producerea enzimelor specifice care adauga la substanta precursoare glucidul specific grupei.

Specificitatea H este determinate de gena H, care prin intermediul enzimei alfa-2-fucoziltransferaza,adauga alfa-L-fucoza la substanta precursoare.

Eritrocitele care poseda numai substanta H sunt de grup O.

Pe substratul H intervine gena A care codifica enzima N -acetilgalactozamintransferaza ce adauga N-acetilgalactozamina pentru grupul H.

Pentru specificitatea B ,enzima D-galactozamintransferaza transport ape acelasi substrat o molecula de D-galactoza.

Importanta cercetarii enzimelor de grup

-elucidarea grupei sanguine in anumite situatii patologice :

-'B castigat' : la unii bolnavi de grup H cu neo de colon si suprainfectii cu E-coli O86, se produce o dezacetilare bacteriana, se pierde un radical N-acetil, iar eritrocitele devin sensibile la actiunea anticorpilor anti-B. Cercetarea enzimelor demonstraza ca genetic bolnavul nu este de grup B ci de grup A.

-In leucemii pe parcursul bolii , antigenul A se pierde , deveninid A slab sau O.

-Cercetarea enzimelor stabileste daca exista o alterare de membrana eritrocitara sau genetica

Frecventa grupelor sanguine OAB in Romania

-grup O = 32.68%

-grup A = 43.15%

-grup B = 16.50%

-grupAB= 7.65%

RELATIILE DINTRE GRUPUL SANGUIN OAB si PATOLOGIE

-Slabirea antigenului A in leucemii.

-Antigen 'B castigat' la bolnavi A cu neo colon sau infectii cu E-coli 86

-Scaderea antigenelor H,A,B in boala Hodgchin.

-Antigenul A este mai slab la nounascuti

-Antigen 'A dobandit' la bolnavi cu stari septicemice, infectii Proteus vulgaris, Proteus mirabilis.

-Absenta sau slabirea antigenului ABH in carcinom de stomac sau pancreas.

-Relatie intre grupul O si ulcerul duodenal .

-Persoanela de grup A mai expuse la anemie feripriva si anemie Biermer.

DIFICULTATI DE GRUPAJ OAB I

Discordanta BV- Simnonin

Martorii : negativi.

Anti-(A+B) anti-B anti-A Er.O Er.A1 Er.A2 Er.B

- - - - - - ++

Martor auto : - Martor alo : -

Martor AB : -

Hemolizine anti-A.

Varianta slaba de grup A (Am sau Ay)

Substante solubile de grup care perturbeaza proba eritrocitara (cc.stomac, pancreas).

DIFICULTATI DE GRUPAJ OAB II

Discordanta intre BV-Simonin

Martori : negativi

Anti-A+B anti B anti A Er.O Er.A1 Er.A2 Er.B

- - - - - - -

Martor auto: - Martori alo: -

Martor AB : -

1. Deficit de imunoglobuline : n.n., LLC

2. Ser proaspat recoltat : complementul inhiba aglutinarea

3. Chimera hematopoetica naturala.

DIFICULTATI DE GRUPAJ OAB III

Discordanta BV-Simonin

Martorii : negativi.

Anti A+B anti-B anti-A er.O er.A1 er.A2 er.B

+++ +++ ++ (+) + - -

Martor auto: -

MartorAB : - Martor alo: -(+)

A2B cu anti A1 seric.

Aloanticorpii iregulari serici.

DIFICULTATI DE GRUPAJ OAB IV

Dubal populatie in BV

Martorii negative

Anti A+B anti B antiA er.O er.A1 er.A2 er.B

+++ - +++ - - - +++

Martor auto: - Martor alo: -

Martor AB : -

1.Transfuzie nonizogrup

2.Sangerare fetomaterna

3.Variante de A (A3)

4.Mozaic (1 singur zigot)-dobandit: modificare leucemica , varsta.

-genetic : fenotip Aend

5.Chimera-hematopoietica :-allogrefa de maduva osoasa

-grefa naturala de cellule suse (gemeni)

-chimere dispermice si alte fuziuni de zigoti.

DIFICULTATI DE GRUPAJ OAB V

Discordanta BV- S

Martorul alo : pozitiv

Anti-A+B anti-B anti-A er.O er.A1 er.A2 er.B

+++ _ +++ + ++ + +++

Martor auto: -

Martor AB : - Martor alo: ++

1.Aloanticorp irregular seric

2.Daca sunt agglutinate toate eritrocitele de grup O: anticorp anti public( in special anti H).

DIFICULTATI DE GRUPAJ OAB VI

Discordanta BV-S

Toti 3 martorii pozitivi

Anti-A+B anti-B anti-A er.O er.A1 er.A2 er. B

+++ +++ +++ +++ +++ +++ +++

Martor auto: +++

Martor AB: +++ Martor alo: +++

1.Autoanticorpi la rece

2.Fenomen de rulouri.

DIFICULTATI DE GRUPAJ OAB VII

Discordanta BV-S

Martoruul auto: pozitiv sau negative

Martorul AB : pozitiv

Martorul alo : negativ

antiA+B anti-B anti-A er.O re.A1 er.A2 er.B

+++ ++ +++ - - +++

Martorul auto: ++sau -

Martorul AB: ++ Martorul alo: -

1.Modificarea in vitro a eritrocitelor (antigen T) Martor auto:++

2.Modificare in vivo: poliaglutinabilitate Martor auto: - in general

-dobandita : infectie (T,B castigat) Tn

-congenitala : HEMPAS

-genetica : fenotip Cad.

IMUNOLOGIA GRUPELOR SANGUINE

ANTIGENUL

Antigenele grupelor sanguine definite prin anticorpii respectivi.

Antigen= substanta care, introdusa intr-un organism si recunoscuta ca straina de acesta, va suscita un raspuns imunitar.Raspunsul imunitar determina o productie de anticorpi care vor reactiona , intr-un mod specific si vizibil, cu acest antigen.

Antigenul se defineste prin :

1. Putere imunogena= capacitatea de a induce anticorpi corespunzatori.
2. Specificitate antigenica= gradul de afinitate intre antigen si anticorp.

1. Puterea imunogena

Dupa origine antigenele sunt :

AA. Heteroantigene : la indivizii unei specii, dar distincti de aceea ai speciei careia apartine subiectul :

-specificitatii ABO se gasesc si in bacteriile saprofite ale intestinului, la animale, in plante.

-Atg. Forssman -pe rinichiul de cobai, hematiile de oaie.Poseda acelasi zahar imunodominant ca si hematiile A, AB (r. incrucisate).

BB. Alloantigene :

-la indivizii din cadrul unei specii date ;

-recunoscuti de anticorpii specifici (alloatc.) produsi la indivizii lipsiti de acel antigen ;

-genetic determinanti ;

-exprima varianta genetica in interiorul speciei ;

-elaborati (direct, indirect) de:

-genele celulelor nucleate (eritroblast)

-genele celulelor mucoase (pt. grupele secretorii );

-genel limfocitelor si megacariocitelor (pt. HLA);

-genele limfocitelor (pt. grupele de Ig);

-putere imunogena functie de diferentele genetice intre indivizi;

CC. Autoantigenele:

-tinte specifice pe care se fixeaza anticorpii de AHA de tip IgG, IgM.

-antigene Hr al sistemului Rh;

-antigenul din sistemul Ii;

-antigen de izotopie Pr;

DD. Structuri biochimice:

I.     -in general : macromoleculele de GM superioare lui 1000 si esential de natura    proteica ;

-polizaharide, lipide, acizi nucleici-asociate cu proteine ;

(haptene= confera specificitate) (confera antigenicitate)

II.       Antigenele de grup eritrocitar :

-glicoproteine (M,N,S) ;

-glicolipide (ABH) ;

-lipoproteine (Rh) ;

2. Specificitatea antigenica= puterea de a se combina doar cu anticorpul

specific.

AA. Specificitatea antigenelor rezulta dintr-un contact stereochimic foarte strans (complementaritate) intre structurile reactive ale antigenului si anticorpului, prin intermediul fortelor de interactiune intermolecumlara necovalente (forte vander Waals, legaturi hidrogenate) de foarte mare eficacitate pe distanta scurta.

Situs antigenic(determinant antigenic)= o regiune limitata de pe suprafata totala a antigenului, care intra in combinatie cu situsul anticorpilor, adica cu o suprafata complementara a moleculei atc.Numarul situsurilor pe diferite celule(de ex. hematii) este variabil :-pe hematii A1 : 10la putera a 6-a situsuri antigenice ; situsuri D : 10000-30000 ; situsuri Fy (a) ; 15000 ; situsuri Kell : 2000-3000

BB.  Reactii incrucisate :

-reactie atg./atc. Specifica= recunoasterea de catre atc. A structurilor moleculare precise de pe antigen.

-Anumitii anticorpi indusi de un antigen pot reactiona si cu un alt antigen ,un antigen poate avea mai multi determinanti antigenici distincti atc. Produsi pot reactiona cu toate antigenele ce poseda acelasi determinant = reactie incrucisata.

Tipuri de reactii incrucisate in functie de structuri :

a) Structura comuna : 2 atg. Pot avea unul sau mai multi determinanti antigenici

identici comuni :-lecitine (Dolichos biflorus= anti A) ;

-atc. Anti A+B ai grupei O recunosc o parte comuna a antigenelor A si

B

b) Structura similara : 2 determinanti antigenici au structuri foarte invecinate atc. pot reactiona cu amandoi determinantii :

i. de ex 'B dobandit ' - pe hematiile A1 in cancere intestinale sau infectii intestinale (deacetilaza bacteriana transforma N-acetilgalactozamina in galactoza cu specificitate B eritrocite agglutinate si de anti-A si de anti-B).

c) Antigene partiale si compuse

i. antigene constituite dintr-un mosaic de structuri, care are fiecare un anti-

corp specific : atg. Rhessus partial (Du).

ii. doua determinante antigenice vecine, ce au fiecare anticorpi specifici,

se pot asocia in spatiu o noua structura ce este recunoscuta de al III-lea

anticorp = antigene compuse.De ex : -atg.Le(a) +H= specificitate Le(b)

recunoscute de atc. Le(b) ; atg.C si e in cis atc. compus Ce recunoscut de

alt anticorp ( nu C sau e).

d) Criptoantigene = antigene specifice unor structuri periferice .Pot fir elevate de:

-absenta constitutionala

-hidroliza enzimatica a hem. A/B apare H, hem. O apare I.

-actiunea neuraminidazei atg. T recunoscut de un anticorp specific present in majoritatea serurilor umane.

ANTICORPII

Anticorpii= produsul raspunsului imunitar, care va reactiona in mod evident cu un

Antigen

=proteina plasmatica , cu functie de recunoastere a antigenului ce l-a

produs.

Anticorpii sunt sintetizati de catre limfocite specializate in raspuns fata de un antigen .Anticorpii sunt imunoglobuline , apartinand clasei de gamaglobuline.

Sunt cinci clase de imunoglobuline si anume Ig : A, A, M, D, E.Imunoglobulinele ca structura sunt proteine formate din lanturi de AA, unite prin punti peptidice.

IgG -structura : 2 lanturi ('grele') dispuse in y

2 lanturi scurte (« usoare')

IgM -structura : mai mari, sunt constituite din 10 lanturi din fiecare tip.

Comparatie intre IgG si IgM

Caracteristici IgG IgM

% din totalul Ig 73 8

G moleculara 150000 900000

Aglutinarea eritrocitelor nu da

in mediu salin

Sensibilizarea eritrocitelor DA DA

Traversarea placentei DA NU

Activarea C +/- DA

Temperatura optima 37*C 8-12*C

de reactie

Tip de anticorpi Imun Natural

Durata de viata 60-70 zile 10 zile

RASPUNSUL IMUN PRIN PRODUCTIE DE ANTICORPI

Organismul expus pentru prima data unui antigen strain produce un raspuns imun primar :-apare latent

-anticorpii pot fi detectabili de abia dupa mai multe luni(IgM in cant. mica)

A doua intalnire cu acelasi antigen - rsapuns secundar in productie de anticorpi :

-productie masiva de atc. (IgG)

-in timp scurt

Anticorpi 'naturali si anticorpi imuni

Atc. naturali = atc. care apar fara o stimulare aparent cunoscuta.

De ex atc. din sistemul OAB

-prezenti la adult

-la nou nascut deloc sau foarte putin

-intre saptamana 12-20=cant. moderata de atc. fara imunizare aparenta cu atg A sau B.

Termenul 'natural' este inselator deoarece atg.A sau B =asemanatoare cu cele ale grupelor sanguine umane se gasesc pe bacterii, virusuri, alimente.Introducerea lor in organism vor forma atc. corespunzatori.

Atc. imuni de grup sanguin = sunt IgG

Produsi ca raspuns fata de un atg. Existent pe eritrocite straine (transfuzii ,la gravide).

Reactia antigen -anticorpi eritrocitari

Tehnicile de utilizare in imunohematologie pentru detectarea reactiei antigen-anticorp bazate pe : a) tehnici de aglutinare a eritrocitelor

a)ocazional= de liza a eritrocitelor

A. Aglutinarea = aglomerarea eritrocitelor datorita fixarii atc. Pe atg. Existente pe eritrocite formarea unei retele ce mentine eritrocitele impreuna.

Procesul se desfasoara in doua etape:

Etapa 1: Contact antigen /anticorp legarea antigenului de anticorp = sensibilizarea eritrocitelor (nu sunt inca agglutinate)

Etapa 2 : Formarea unei retele ce antreneaza aglutinarea eritrocitelor.Daca sunt conditii favorabile ,atc. Poate iinduce o aglutinare fizica a eritrocitelor.

IgM cu 10 situsuri de fixare antigenica. Ele sensibilizeaza si aglutineaza in acelasi timp, direct.

FACTORI CARE INTERVIN IN REACTIA ANTIGEN-ANTICORP

1.Incarcatura ionica a eritrocitelor.

-Eritrocitele au incarcatura electrica negative fenomen de respingere intre ele in stare fiziologica ele nu aglutineaza nici 'in vivo' si nici 'in vitro' (incarcatura electrica negative='potential zeta').

-Incarcatura negative este datorata radicalilor acizi neuraminici prezenti pe membrana eritrocitara.

-Imunoglobulinele IgG sensibilizeaza eritrocitele,acestea ramanand insa despartite prin distante infirme.

IgM aglutineaza (leaga) direct eritrocitele.

2. Temperatura de actiune a diferitilor anticorpi (optimum termic) este diferita:

-4-18 *C pentru atc. ABO

-37*C pt atc. Rh

3. pH optim este 6.5 -7 pentru majoritatea atc.

Reactiile sunt inhibate prin exces de aciditate sau alcalinitate

4.Prospetimea serului si a eritrocitelor

-Cele mai bune reactii : ser proaspat si eritrocite proaspete

(conservarea la -20*C daca serul nu e utilizat)

5.Raport calitate anticorpi/cantitate antigene

-Reactie mai puternica atunci cand cantitatea de atc. e mai mare decat cea de atg. Eritrocitare

-Suspensia optima de eritrocite pentru aglutinare :2-4%

6.Forta ionica

-Viteza de reactie atg./atc. creste atunci cand forta ionica a mediului de suspensie a eritrocitelor scade.

-Utilizarea solutiei hipotonice (liss,BF) reduce perioada de incubatie la 15'.

Aglutinarea eritrocitelor sensibilizate de anticorpi

1. Albumina

-Albumina= molecule mari, incarcate electric pozitiv, care au capacitatea de a apropia eritrocitele sensibilizate de IgG. IgG se fixeaza pe antigenele eritrocitelor vecine aglutinate.

-Utilizarea albuminei :

-mediu albuminos

-adaugarea albuminei la reactivi pentru a creste puterea aglutinata

-incubare atg. +atc. adaugarea de albumina.

2. Testul antiglobulinic

-Utilizarea de ser antiglobulinic care detecteaza globulinele umane fixate pe eritrocite sensibilizate

-se realizeaza in trei etape:

-Sensibilizarea=incubarea serului cu eritrocite

-Spalarea=indeparteaza proteinele serice si IgG nefixate

-Adaugarea de ser antiglobulinic (AG):

-daca eritrocitele sunt sensibilizate de IgG sau C3 vor fi agl. (r.poz)

-daca lipsesc atc. Fixate pe eritrocite, acestea nu vor fi agl. (r. neg)

3. Utilizarea de enzyme proteolitice(papaina, bromelina,ficina)

-Indeparteaza o parte din acidul neuraminic , reduce incarcatura negative , aproprie eritrocitele, permite aglutinarealor catre IgG.

-IgM aglutineaza si ele eritrocitele tratate cu enzyme, reactie puternica in anti-A,B.

-Nu detecteaza toti anticorpii ,enzimele distrug unele antigene(MN,..) deci e o tehnica complementara celorlalte(in mediu salin, albuminos, antiglobulinic).

COMPLEMENTUL

Complementul=proteina serica normala,uneori implicate in r. de grup sanguine si in tulburari imunologice.

Complexul atg./atc. activeaza o suita complexa de componente din ansamblul complewmentului care poate duce fie la liza directa a eritrocitelor, fie la sensibilizarea lor prin componentul C3.

Eritrocitele sensibilizate de C3 sunt eliminate cu ocazia trecerii lor prin ficat.Altele raman in sangele circulant si sunt detectate cu testul antiglobulinic anti C3.

Componentii complementului :

-labili, se denatureaza rapid.

-activitatea complementului scade in timpul conservarii la 4-8*C precum si la 56*C.

Clea de activare a complementului

Complexe atg./atc. +C1

Sensibilizarea eritrocitelor C3 Liza eritrocitelor

De catre C3

TEHNICI SEROLOGICE

I.     Securitatea personala-atentie la manipularea sangelui !

II.       Echipamentul pt srologia de rutina

Centrifuga

Frigider- pt. Reactivi, eritrocite, probe de sange.

Congelator- stocare esantioane ser ; seroteca(-20*C/-40*C)

Placi de opalin de sticla ( cu godeuri).

Termostat 37*C- termometru.

Recipienti pt ser fiziologic (SF)

Pisete de plastic pt. spalare(250ml, 500ml)

Pipete Pasteur.

Epribete(sticla, plastic)-50-70mm 1/5mm. O interior.

Stative pentru eprubete

Lame pt microscop

Creioane markeri rezistenti la umezeala (apa)

Microscop( molecular/biocular)

Hartie pH-metru

Apa distilata sau deionizata

Linii pt micrometode de hemaglutinare

Microplaci

Hartie absorbanta (15*15cm)

Cristalizoare

Pahare Berzelius

Pipete gradate (1ml, 2ml, 5ml)

Baie terostat cu t* reglabila (56*C, 70*C).

Solutia salina (ser fiziologic-SF) pentru eritrocite

Conditii pentru obtinerea de bune rezultate :

-pH 6.5-7.5

-proaspata : 24 ore isi pastreazapH-ul

-In cazul invechirii ei (2-3 zile) pH-ul creste si este necesara aditionarea unui tampon cu pH=7(tampon fosfat) 10ml la 1L ser fiziologic.

Preparare : 8.5g NaCl in 1000ml apa distilata (AD) sau deionizata proaspata.Masurare Ph=6.5-7.5.

Pipeta Pasteur

-pipeta de sticla de 5ml , efilata la un capat.

-elibereaza picaturi de aprox. 0.02ml (in functie de pozitia de pipetare)

-pozitia corecta de lucru- verticala.

-foarte curata : spalare in ser fiziologic si uscare pe hartie de filtru

-Atentie la ranirea cu pipeta sparta.

Lame de sticla sau placi de opalina

-pt det gr sanguine, Rh, etc.

Tuburi de sticla, plastic

-de preferinta cu utilizare unica.

-pt. Test Coombs

-pt. Cercetare ,titrare anticorpi

-pt. Determinare grupe, Rh in tub.

-N.B. Daca se refolosesc, foarte bine degresate sis palate!

Microplaci

-mai economice

-96 de godeuri cu fund diferit : - in V, plat, in U (bune pt hematologia eritrocitara.

Atentie= spalare, uscare foarte atenta!! (eliminarea urmelor de ser).

LECTURA REACTIILOR

Pe lama sau placa de opalin

a) Ser+ eritrocite omogenizare zona de 2 cm.

b) Balansare

c) Citire in 2'-5'.

Tehnica in tub

-Incubare 45'-60' pt decantarea eritrocitelor (sau centrifugare usoara)

-Citirea-aglutinarii (prin rotire usoara)

-hemolizei

Tehnica pe microplaca

-Decantarea eritrocitelor prin incubare sau centrifugare usoara.

-cercetarea hemolizei si /sau aglutinarii cu ochiul liber ( lovirea usoara a marginii) sau cu un cititor de microplaca.

INTERPRETAREA REZULTATELOR

(intensitatea reactiei)

4+ = aglutinare completa

3+ = aglutinarea si cateva eritrocite libere

2+ = aglutinare vizibila cu ochiul liber

1+ = aglutinare slab pozitiva cu ochiul liber, vizibila bine cu lupa.

(-) = lipsa aglutinarii

L(H) =liza(hemoliza ) eritrocitelor.

REACTIVI DE GRUPAJ SANGUIN

A.Reactivi -- Policlonale---umane----- ----- ------naturale

---uneori animale --imune

-monoclonale * se obt din culturi de celule (hibridoame) care fabrica atc.

*avantaje : disponibile in cantitati aproape nelimitate

riguros identice

foarte specifice

lipsiti de atc. de contaminare care dau r. fals poz

lipsiti de virus HIV, HBs, HCV.

*utilizati strict conform instructiunilor

*foarte sensibili la variatii de pH.

1.Grupaj OAB : -antiA+B, antiB, antiA.

2.Grupaj Rhesus: -anti-D, anti-C, anti-c, anti-E, anti-e, anti-C

3.Reactivi pt det. Altor antigene eritrocitare:

-anti-kell, anti-cellano, anti-Kp(a), anti-Kp(b), anti-P1, anti-M, anti-S, anti-N, anti-s, anti-Le(a), anti-Le(b), anti-Duffy(a), anti-Duffy(b), anti-Kidd(a), anti-Kidd(b), (Jk(a), Jk(b))

4.Reactiv antiglobulinic:

-polivalent(polispecific)

-monospecific( anti-IgG, IgM, C3d/c, IgA).

5.Lectine: reactivi de origine vegetala sau animala:

* reactivi anti-H din Ulex Europaeus sau din ser de tipar (monoclonal)

*reactiv anti-A1 -extract din Dolichos biflorus

6.Reactivi martor(foarte importanti in imunohematologie):

-solutii saline

-martori albumina(pentru Rh)

-ser AB fara C, fara anticorpi iregulari- rece/cald

ERITROCITE PENTRU GRUPAJ

-de determinat -pot fi spalate- 1*pentru cele din sange simplu

2*pentru cele pe anticoagulant

(prin spalare se elimina urmele de plasma, ser microchea-

guri, eritrocitele lizate)

-se folosesc in suspensie2-4% in SF

1. test ( proba Simonin) proaspete- A1, A2, B, O

2. pentru depistajul anticorpilor iregulari - 2-4 esantioane, purtand antigenele din principalele sisteme importante.

3. identificarea anticorpilor iregulari (10-11 esantioane)

4. paneluri speciale (referinta, antigene rare, publice).

STOCAREA ANTISERURILOR SI A ERITROCITELOR

Antiserurile: -la 4*C

-nu se decongestioneaza decat 1 data.

-se omogenizeaza dupa decongelare

-control zilnic

Eritrocitele: -pentru proba Simonin= preparate zilnic sau conservate 48 ore (cu controlul hemolizei)- control zilnic.

Notate informatiile cand se primesc reactivii:

-data livrarii

-originea

-conditii de stocare

-data inceperii utilizarii lor

-numarul lotului

-data expirarii

-observatii asupra problemelor survenite in cursul utilizarii.

Testarea reactivilor inaintea utilizarii-pentru asigurarea fiabilitatii lor

-Antiserurile pe o baterie martor ( la inceput) retestare pentru fiecare lot de testes au cel putin o data pe zi.

-Eritrocitele zilnic.

METODE

I.GRUPAJ ABO SI Rh (D)

-Simultan cu serurile monoclonale

-Grupaj ABO : -in solutie salina

-la temperatura camerei

-Cu seruri anti-D : conform indicatiilor de utilizare :

- lama : -temperatura camerei

-incubare la 37*C

- tub : -temperatura camerei

-37*C -TCI

A. Pe placa - tehnica de rutina

Donatori : OAB - BV si Simonin

- la fiecare donare

Rh(D) : - doua seruri anti-D rezultat negativ obligatoriu TCI

-pentru D slab

Bolnavi : OAB -BV si Simonin

Rh(D)-2 seruri anti-D cu control anti-D, D(u) se cerceteaza doar daca e introdus in practica Laboratorului.

Nou nascut :-OAB - doar BV pana la 3 luni.

B. In tub- pentru precizari de grup ABO , RhD :

-macrometoda

-TCI

C.Pe microplaca

III.CERCETAREA ANTICORPILOR IMUNI

-La politransfuzati, multipare, gravide

-Prin : A. Test antiglobulinic

B. Test in mediu albuminos

C. Teste enzimatice

A. Testul antiglobulinic

a. Testul antiglobulinic indirect (Testul Coombs Indirect- TCI)

Principiu : evidentierea cu ajutorul unui ser antiglobulinic, a anticorpilor fixati pe eritrocite , care nu produc o aglutinare directa.

Etape:

1.Sensibilizarea:- Incubarea eritrocitelor spalate de 3 ori cu SF + ser de cercetat (2 parti ser + 1 parte buton eritrocitar),incubare la 37*C, in timp de 40'-60' in solutie salina sau 15' in mediu cu putere ionica scazuta (LISS).

Proportii, mai ales pentru anticorpii slab reactivi: 3-4 picaturi ser+1 picatura eritrocite sediment.

SAU

2 picaturi ser+ 2 picaturi eritrocite 2-4% in LISS

Dupa incubare se cerceteaza hemoliza sau aglutinarea, inainte de spalare.

2.Spalarea : -Elimina orice urma de ser.

-De 3* in SF cu pH 6.5-7.5 ( nerespectarea pH-ului anticorpii sensibilizati se elueaza la spalare).

3.Adaugarea de -Conform instructiunilor fabricantului

ser antiglobulinic -De obicei 2 picaturi

-Centrifugarea imediata

-Citire macroscopica si microscopica.

In caz de rezultat negativ : se adauga in eprubeta respectiva eritrocite sensibilizate cu IgG+ ser antiglobulinic centrifugare citirea rezultatului :

-pozitiv : rezultat initial negativ corect

-negativ : serul antiglobulinic a fost neutralizat ; se reface testul.

Cauzele reactiilor fals positive si fals negative

Reactii fals positive Reactii fals negative

-eprubetele murdare (praf,corpuri straine -spalare insuficienta a eritrocitelor

-contaminare de la o epribeta la alta -neadaugare de ser antiglobulinic

-centrifugare prea rapida sau prea lunga -eprubete murdare

-microcheaguri

-pH neadecvat al SF

-viteza de centrifugare neadecvata

-interval de spalare si adaugarea de ser anti-

globulinic

-interval intre adaugarea de ser antiglobuli-

nic si lectura.

b. Testul antiglobulinic direct (Testul Coombs Direct- TCD)

-evidentiaza sensibilizarea eritrocitelor "in vivo" (in AHAI, boala hemolitica a nou nascutului, reactii transfuzionale )

-testarea directa a reritrocitelor bolnavului.

TCD Pozitiv in:

-AHAI : distrugerea 'in vivo' a eritrocitelor de catre un autoanticorp

-R. hemolitica post -transfuzionala : distrugerea 'in vivo' a eritrocitelor transfuzate de catre alloanticorpii pacientului.

-Boala hemolitica a nou nascutului : distrugerea 'in vivo' a eritrocitelor fetale de catre IgG materne care au traversat placenta.

B. Teste in mediu albuminos

-Mai putin sensibil

Utilizare -cand nu este ser antiglobulinic

-cu anumiti reactivi anti-D pentru determinarea Rho(D)

Etape 1. Incubare ser + eritrocite la 37*C (dupa incubare se decanteaza serul, eritro-

citele raman pe fundul eprubetei)

2.Se adauga albumin ape peretii eprubetelor incubate la 37*C timp de 10'-15'

-se observa aglutinarea eritrocitelor sensibilizate.

C.Tehnici enzimatice

-evidentiaza anticorpii imuni in anumite sisteme eritrocitare (pt. ca unele antigene sunt distruse de enzyme).

-Utilizare: complementar cu testul antiglobulinic sin u inlocuitor al acestuia (tehnica de centru de referinta).