Electroforeza

ELECTROFOREZA

Determinarile prin electroforeza se bazeaza pe proprietatile particulelor ionizate de a migra intr-un camp electric. Astfel, daca se stabileste o diferenta de potential intre extremitatile unei benzi de hartie (gel sau alte materiale), impregnata cu un electrolit convenabil, picatura de solutie continand particulele de analizat, fiind depusa pe banda, constituientii ionici se deplaseaza sub actiunea campului electric cu viteza lor proprie. Aceasta viteza poate fi urmarita si masurata.

Mobilitatea electroforetica a particulelor se defineste ca distanta parcursa pe secunda intr-un camp electric de forta electrica egala cu o unitate de potential si este data de relatia:

unde : U - mobilitatea electroforetica a ionului (cm²/Vs); d - distanta parcursa de component pe hartie (cm); l - lungimea benzii de hartie (cm); t - durata electroforezei (s); V - diferenta de potential (Volti); l'/l - factor de corectie care caracterizeaza sinuozitatea fasciculelor capilare ale hartiei si depinde de tipul de hartie folosit (pentru hartia cromatografica Schleicher-Schull 202, l'/l = 0,58 ± 0,06).

Viteza de migrare a ionilor depinde de mai multi factori si anume: sarcina electrica, marimea si forma particulelor, forta ionica, vascozitatea si pH-ul electrolitului, tensiunea aplicata, temperatura, natura suportului solid (hartie cromatografica, acetat de celuloza, gel, etc.).

Migrarea particulelor in campul electric se produce spre polul de semn opus incarcarii particulelor respective. Astfel, particulele cu sarcina pozitiva migreaza spre catod (cataforeza) iar cele cu sarcina negativa spre anod (anaforeza). La punctul izoelectric, nu are loc migrarea electroforetica.

Sensul migrarii particulelor, este influentat si de pH; astfel in mediu bazic sarcina este negativa, ceea ce determina o migrare spre anod; la pH neutru sarcina fiind pozitiva particulele se deplaseaza spre catod, iar in cazul in care se formeaza combinatii complexe, sensul migrarii este in functie de incarcarea ionilor rezultati. Solutia de electrolit (sau sistemul tampon) trebuie sa fie in asa fel aleasa incat sa permita separarea neta a compusilor probei de analizat, fara sa reactioneze cu acestia. Forta ionica (μ) a electrolitului trebuie sa fie bine corelata cu tensiunea aplicata precum si cu timpul de electroforeza. Daca se utilizeaza solutii tampon cu o, forta ionica μ = 0,05 - 0,1 trebuie sa se aplice o tensiune mica pe o durata de timp mai lunga. Reducerea duratei de migrare se realizeaza prin scaderea fortei ionice (μ = 0,05 sau mai mica) si ridicarea tensiunii. Ca electroliti se utilizeaza solutii tampon (aminoacizi), solutii diluate de electroliti tari (KCI, KNO₃, etc.), solutii ale acizilor slabi (acid tartric, acid citric, acid acetic) sau a sarurilor lor cu baze tari, etc.

Suportul solid in electroforeza poate fi: hartia cromatografica, foi de acetat de celuloza, geluri de agaroza 1%, agar-agar 1,5%, amidon, etc.

Aparatura necesara este compusa din: generator de curent continuu CONSORT EV232 cu tensiune variabila, camera de electroforeza cu doua compartimente care contin solutia de electrolit si cei doi electrozi de platina sau carbune.

Descrierea aparatului si modul de lucru Aparatul propriu-zis de electroforeza pe suport solid, propus de Condsen, Gordon si Martin se poate utiliza la o tensiune foarte ridicata de 1500 V. El consta dintr-o

cuva de material plastic (1) prin care circula apa termostatata care asigura racirea suportului solid, doua celule din material plastic (4) cu doua compartimente in care se introduce electrolitul si electrozii. Electrozii sunt din platina sau carbune si sunt conectati la redresorul de curent, in cuvele de electroforeza (4) se introduce electrolitul (sau solutia tampon) in asa fel incat volumul de solutie sa fie acelasi in ambele compartimente. O bucata de hartie de filtru (a), (3 x 2,5 cm) imbibata cu electrolit se fixeaza pe peretele despartitor al celulei astfel incat sa adere pe acesta. Alta banda de hartie (b), (8 x 2,5 cm) imbibata cu electrolit se acopera cu celofan si se fixeaza pe peretele exterior al celulei lipita de acesta. (Pentru cealalta cuva se procedeaza identic). Se fixeaza celulele pe stativ si se aplica capacele cuvelor care sunt prevazute cu electrozii (3) urmarindu-se coincidenta semnelor de pe capac si corpul cuvei. Banda de hartie cromatografica (c), (36 x 4 cm) la care se marcheaza mijlocul (18 cm) si polii (+ si -) la capete, se umecteaza cu electrolit, iar excesul de electrolit este indepartat prin tamponarea benzii intre doua hartii de filtru.

Se asaza banda pe aparat avand grija ca mijlocul hartiei sa coincida cu mijlocul aparatului. Se marcheaza linia de start (in partea inferioara si superioara a liniei de mijloc) cu o solutie de glucoza 1%.in mijlocul benzii (pe linia de start) se aplica proba cu o capilara de sticla. Se realizeaza contactul dintre electrolit si banda prin intermediul benzilor acoperite cu celofan, se aseaza deasupra placa de sticla (2) si cele doua bucati de material plastic care asigura contactul intim dupa ce in prealabil s-a verificat umplerea cuvei electroforetice cu apa, care va raci continuu sistemul. Dupa ce se verifica instalatia, se deschide intrerupatorul de la redresorul de curent si se noteaza timpul.

MODUL DE UTILIZARE AL SURSEI DE TENSIUNE CONSORT EV 232 PENTRU SEPARARI ELECTROFORETICE

1. Verificati ca aparatul este scos din priza
2. Verificati ca aparatul este inchis - comutatorul general negru din coltul din dreapta jos este pe pozitia "O"
3. Conectati electrozii de grafit la cei doi poli (pozitiv si negativ) ai sursei de tensiune
4. Introduceti aparatul in priza
5. Porniti aparatul trecand comutatorul general negru din coltul din dreapta jos pe pozitia "I"
6. Apasati butonul "SET/ENTER" si alegeti modul "MANUAL" cu ajutorul sagetilor
7. Apasati butonul "SET/ENTER" si setati tensiunea de operare la 550V cu ajutorul sagetilor
8. Apasati butonul "SET/ENTER" si setati intensitatea maxima admisa a curentului de operare la 10mA cu ajutorul sagetilor
9. Apasati butonul "SET/ENTER" si setati puterea maxima admisa la 10W cu ajutorul sagetilor
10. Apasati butonul "SET/ENTER" si setati unitatea de timp la ore ("HOURS") cu ajutorul sagetilor
11. Apasati butonul "SET/ENTER" si setati timpul de operare la 30 minute (00:45 h) cu ajutorul sagetilor
12. Porniti analiza electroforetica prin apasarea butonului "RUN/STOP"

ATENTIE: Este interzisa atingerea oricarei parti a sistemului electroforetic (sursa de tensiune, cabluri, electrozi de grafit, baie de racire, etc.) pe tot parcursul perioadei de operare a acestuia!

13. Terminarea experimentului este anuntata de un semnal sonor
14. Opriti analiza prin apasarea butonului "RUN/STOP"
15. Opriti aparatul trecand comutatorul general negru din coltul din dreapta jos pe pozitia "O"
16. Deconectati aparatul de la sursa de tensiune
17. Deconectati electrozii de grafit

Dupa parcurgerea timpului propus se intrerupe furnizarea curentului, se ridica placa de sticla (2), iar banda de hartie se usuca cu aer cald sau in etuva, dupa care se reveleaza startul marcat cu glucoza, (cu anilina-acid ftalic si uscare la 105° C, cand apare o coloratie bruna), iar ionii de determinat se identifica prin pulverizare cu reactivi potriviti de-a lungul benzii, in sensul migrarii (+ sau -).

Pentru determinarea mobilitatii electroforetice se masoara distanta de la mijlocul spotului la startul corectat cu glucoza, (d) si lungimea benzii de hartie (l), celelalte marimi fiind cunoscute (t, V, l'/l).

ACTIVITATE PRACTICA

Sa se determine mobilitatile electroforetice ale ionilor Cu²⁺, Co²⁺ si Ni²⁺ si sa se separe electroforetic ionii Cu²⁺, Co²⁺ si Ni²⁺ dintr-un amestec;

Observatii La toate determinarile se utilizeaza ca electrolit o solutie de KNO₃ 0,1 N, iar ca suport, hartia cromatografica Schleicher-Schull 202, la care raportul l'/l =0,58 ±0,06.

Solutiile standard si amestecul se vor aplica cu ajutorul unor capilare de stical sau a unei micropipete.

Timpul de migrare pentru este de 30 min.

Revelarea spoturilor (vizualizarea) se face prin pulverizarea benzii de hartie (uscata in prealabil cu foen-ul) cu o solutie de acid rubeanic, iar daca spoturile nu sunt perfect conturate, banda de hartie se va expune la vapori de amoniac, in aceste conditii acidul rubeanic formeaza cu ionii Cu²⁺, Co²⁺ si Ni²⁺, rubeanati colorati caracteristic (galben pentru Co²⁺, albastru pentru Ni²⁺ si verde pentru Cu²⁺).

Marcarea punctului de start pe banda electroforetica (punctul izoelectric) se face cu glucoza si se vizualizeaza prin pulverizare cu anilina-acid ftalic si incalzirea benzii la 105°C, cand apare o pata brun-inchisa, sau se aseaza banda electroforetica in asa fel incat mijlocul ei (marcat cu creionul) sa corespunda exact cu punctul izoelectric marcat pe aparat.

In toate cazurile, tensiunea aplicata este de 550 V, iar intensitatea maxima de curent se fixeaza la 15 mA.

Pentru toate determinarile se calculeaza mobilitatile electroforetice ale ionilor, care se vor trece in tabelul de mai jos.

Tabel 1. Determinari electroforetice