Recombinarea genetica la eucariote

RECOMBINAREA GENETICA LA EUCARIOTE

Recombinarea genetica este procesul prin care are loc transferul intra- sau intermolecular a unor secvente de ADN, avand ca rezultat modificari in inlantuirea genelor sau a unor parti din gene. Se poate produce astfel, reasortarea unor nucleotide la nivelul aceleiasi molecule de ADN sau intre molecule separate, rezultand, in final, una sau doua molecule recombinate.

La eucariote procesul de recombinare genetica este legat de fenomenul sexualitatii si se realizeaza in special in cursul meiozei, fiind conditionata de realizarea contactelor intre cromosomi urmata de disjunctia independenta a perechilor de cromosomi (bivalenti). In cazul organismelor eucariote au fost descrise 3 tipuri de recombinare genetica:

recombinarea intracromosomala - prin crossing-over (schimbul reciproc de segmente cromosomale);

recombinarea intercromosomala - prin disjunctia independenta a cromosomilor omologi;

recombinarea genetica nereciproca - prin conversie genetica.

Recombinarea intracromosomala (crossing-over) se realizeazaatat in meioza cat si in mitoza.

Ea poate avea loc intergenic, cat si intragenic.

Recombinarea intragenica este un fenomen rar. Acest fenomen manifesta interferenta negativa care determina cresterea probabilitatii ca un al 2-lea crossing-over sa aiba loc in apropierea primului.

Formarea bivalentilor in meioza presupune participarea a 2 cromosomi de origine diferita (materna si paterna), intre care se stabilesc contacte intercromatidice (sinapse) ce conduce la formarea unei structuri specializate numita complex sinaptinemal.

Importanta complexului sinaptinemal in desfasurarea recombinarii genetice intracromosomale este dovedita de faptul ca la organismele la care nu se produce acest complex, nu are loc procesul de crossing-over.

Formarea chiasmelor este dependenta de sinteze proteice ce au loc la sfarsitul zigotenului.

Procesul de recombinare genetica implica ruperea si reunirea cromatidelor participante, fapt ce conduce la un schimb reciproc de segmente de ADN de dimensiuni egale si la aparitia de cromosomi (iar apoi de gameti) recombinati (Fig. 1).

Fenomenul de crossing-over se realizeaza mai mult sau mai putin randomic, de-a lungul perechilor de cromosomi omologi. Astfel, probabilitatea realizarii recombinarii intre 2 loci creste odata cu distanta dintre acestia pe cromosomi.

Deoarece procesul de crossing-over afecteaza numai 2 dintre cromatidele bivalentilor, doar 50 % dintre produsii meiozei sunt de tip recombinat, restul de 50 % sunt de tip parental.

S-a constatat ca intre genele plasate pe cromosomii omologi, in afara de crossing-over simplu, pot aparea si crossing-overe multiple (Fig.2). Daca procesul de recombinare are loc la nivelul unor gene heterozigotze, indiferent de numarul de crossing-overe ce se realizeaza, procentul de recombinare nu depaseste 50 %.

Procesul recombinarii genetice poate avea loc si in celulele somatice. Schimburile intercromatidice (sister chromatid exchange) au fost evidentiate mai ales in celulele mamaliene aflate in cultura in vitro, ele nefiind urmate, de obicei, de modificari fenotipice deoarece cromatidele implicate sunt identice.

Fenomenul recombinarii mitotice a fost studiat in special in cazul fungilor (Aspergillus nidulans, S. cerevisiae) la care in ciclul de viata predomina haplofaza.

Recombinarea mitotica poate avea loc in cursul metafazei si presupune asocierea cromosomilor omologi si realizarea schimbului genetic inainte de diviziunea centromerului.

Procesul de crossing-over se poate produce si la nivelul aceleiasi gene (crossing-over intragenic).

In mecanismul molecular al recombinarii genetice de tip crossing-over, sunt implicate proteine specifice, procesul recombinarii fiind asociat cu cel de reparare genetica.

Recombinarea intercromosomala are loc prin disjunctia independenta a perechilor de cromosomi care reprezinta suportul material pentru disjunctia perechilor de factori ereditari.

Segregarea independenta are loc la trecerea celulelor sexuale de la metafaza I la anafaza I, cand are loc asezarea intamplatoare a cromosomilor de origine materna sau paterna deasupra sau dedesubtul planului ecuatorial al placii metafazice.

Acest comportament al cromosomilor de origine matena, care se imperecheaza cu cei de origine paterna si apoi separarea perechilor respective, a fost comparat de catre Muller cu formarea perechilor de dansatori in timpul dansului si separarea lor la sfarsitul acestuia. Din aceasta cauza, Muller a denumit acest comportament dansul cromosomilor . Cu cat numarul cromosomilor si a genelor continute este mai mare cu atat numarul de combinatii posibile de gameti si de organisme este mai mare. Posibilitatea ca un organism sa fie asemanator cu altul este de (1/2)²ⁿ, in care n =numar de perechi de cromosomi, iar 2n reprezinta numarul total de cromosomi din complementul speciei respective.

Conversia genica este o recombinare nereciproca. In cadrul conversiei genice, un segment din molecula de ADN a unei cromatide se desprinde si se ataseaza de alta cromatida. Este posibil, in acest mod, ca un cromozom sa contina o gena in doua exemplare (daca transferul s-a realizat intre cromozomi omologi), iar altul o gena in minus. Are loc cu o frecventa mai mare in cursul diviziunii meiotice dar poate avea loc si in celulele somatice. Ea a fost evidentiata prin analiza tetradelor la ciupercile din genurile Saccharomyces, Aspergillus, Neurospora unde apar abateri de la raportul normal de segregare alelica, ca si cum se produce o transformare a alelei A in a (Fig. 3).

Frecventa recombinarii genetice nereciproce poate creste de la un capat la altul al unui locus genic, fenomen numit polarizarea conversiei. Astfel , la fungi, in locul raportului de segregare normal de

4 : 4, se intalnesv valori diferite ale acestui raport: 6 : 2, 5 : 3, 7: 1 sau chiar 8 :0. fenomenul conversiei genice a fost evidentiat si la plante, in cazul unor gene ce intervin in determinismul pigmentatiei, precum si la virusuri (in special bacteriofagi). Unii autori considera ca, de fapt, conversia genica este consecinta unui proces de recombinare, in urma caruia apar nepotriviri ale unor baze azotate situate pe cromatide omoloage. Aceste zone de nepotrivire sunt reparate prin excizie si prin adaugarea nucleotidei corespunzatoare. Prin reparatie poate reaparea astfel, tipul normal.

Curs 12- Genetica

RECOMBINAREA GENETICA LA PROCARIOTE

La procariote au fost descrise mai multe cai de transfer de material genetic: transformare genetica, conjugare, sexductie si transductie, asociate cu mecanisme ce asigura integrarea noii informatii genetice in genomul gazdei. Indiferent de natura sa, transferul de gene reprezinta un fenomen in care moeculele informationale isi schimba gazda, avand de traversat doua bariere celulare: una la iesire din celula donatoare si alta la intrarea in celula receptoare.

1. Transformarea genetica

Fenomenul transformarii genetice a fost descoperit in 1928 de catre Griffith, in urma experimentelor realizate cu pneumococi asupra soarecilor. Ulterior , Avery, Mac Leod si McCarthy, au descoperit, in 1944, ca agentul transformant este reprezentat de ADN izolat din celulele bacteriene.

Transformarea genetica la bacterii presupune transferul unui fragment de ADN (cromosomal sau plasmidial) de la o bacterie donatoare si incorporarea acestuia in genomul unei bacterii receptoare.

Asemenea fragmente de ADN sunt, in general, de dimensiuni mari (in medie de 20.000 perechi de nucleotide), putand contine gene utile care, patrunse in bacteria receptoare, pot inlocui printr-un proces de recombinare o secventa de nucleotide omoloaga din genomul acesteia. Informatia genetica nou integrata in cromosomul bacteriei receptoare este transmisa stabil de-a lungul generatiilor.

Fenomenul de transformare genetica a fost evidentiat prima data la pneumococul Diploccocus pneumoniae si ulterior la Bacillus subtilis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Staphylococcus sp., etc.

Pentru a putea prelua ADN exogen din mediul extracelular, celulele receptoare trebuie sa manifeste o

anumita stare specifica numita stare de competenta. Aceasta presupune ca peretele celular si membrana celulara ale celulei bacteriene receptoare sa fie permeabile pentru ADN exogen, iar celula sa se afle intr-o anumita faza a ciclului de viata care sa permita acceptarea acestuia. In cursul realizarii competentei are loc activarea unor receptori specifici localizati la nivelul peretelui celular cu rol de legare a ADN exoged la suprafata celulara. Numarul receptorilor activi, variaza de la o specie bacteriana la alta, de exemplu: la Streptococcus au fost identificati 80 de receptori, la Bacillus subtilis - 50, iar la Haemophilus doar 4 receptori.

La unele specii bacteriene, starea de competenta este o stare naturala, fiziologica, aparand intr-o anumita etapa a ciclului de viata si dureaza un anumit interval de timp. De exemplu, la Azotobacter, Staphylococcus, Pneumococcus competenta este maxima pe parcursul fazei logaritmice, in timp ce la alte specii - Bacillus, Pseudomonas, Methylobacterium- competenta este maxima la trecerea de la faza logaritmica la cea stationara.

In cazul altor specii, starea de competenta poate fi indusa prin tratamente specifice (soc de temperatura, adaugarea unor ioni etc.).

Intr-o populatie bacteriana, proportia celulelor capabile de a prelua ADN exogen poate fi estimata pe baza frecventei de transformare, urmarind un anumit marker genetic. Pentru a se obtine o frecventa ridicata de integrare/ transformare, este necesar ca ADN transformant sa provina de la o tulpina bacteriana inrudita (ADN omolog). In cazul utilizarii unor organisme neinrudite (ADN heterolog), eficienta procesului de transformare este foarte scazuta.

Multe bacterii se pot liza in mod natural, mai ales in timpul etapelor finale ale ciclului celular. In aceste conditii, ADN este eliberat in mediu extracelular de unde poate fi preluat de alte bacterii aflate in aceeasi populatie.

La bacterii, procesul natural de transformare genetica (cu fragmente de ADN cromosomal eliberat prin metoda lizei celulelor bacteriene) se realizeaza in mai multe etape:

1. legarea reversibila (adsorbtia) a moleculelor de ADN dublu catenar, la nivelul situsurilor receptoare aflate pe suprafata celulara;
2. preluarea ADN exogen de catre celulele competente;
3. convertirea ADN dublu catenar la forma monocatenara, prin degradarea uneia dintre catenele moleculei initiale;
4. integrarea segmentului de ADN monocatenar in cromosomul celulei receptoare;
5. segregarea si exprimarea fenotipica a noii informatii genetice integrate in genomul celulei gazda.

Procesul de transformare este destul de raspandit in natura, mai ales in cazul tulpinilor bacteriene inrudite, el jucand un rol important in evolutia bacteriilor. Aceasta concluzie este intarita si de observatia ca transferul de gene prin transformare genetica are loc nu numai pe orizontala (intre bacterii inrudite) ci si intre grupe de organisme neinrudite (fenomen ce explica, de exemplu, raspndirea rezistentei la antibiotice).

2. Conjugarea bacteriana

Conjugarea bacteriana reprezinta un mod de transfer unidirectional de ADN de la o celula donatoare la o celula receptoare prin intermediul unei legaturi intercelulare directe (pil de sex) si conditonat de prezenta in bacteria donatoare a unui element genetoic specializat numit conjugon.

Fenomenul conjugarii a fost descoperit in 1946 (de catre Lederberg si Tatum) in urma experimentelor cu tulpini de Escherichia coli ce contineau sau nu o plasmida specifica notata F. Din acest punct de vedere, celulele bacteriene care contin plasmida F ( factorul F) sunt notate F ⁺, iar cele care nu contin aceasta plasmida sunt notate F ^-. In cazul bacteriilor Gram negative, in afara de plasmida F, functiile necesare procesului de conjugare se gasesc la nivelul mai multor plasmide. De exemplu, in cazul plasmidelor de rezistenta la antibiotice (plasmida RP4) si plasmidele Col ce contin determinanti genetici pentru sinteza colicinelor.

Factorul F este alcatuit din ADN dublu catenar circular cu o lungime de 94,5 kb si in numar de 1-2 copii/celula. Transferul prin conjugare al acestor plasmide se datoreaza prezentei unei regiuni specifice, regiunea tra, ce reprezinta cca 30 % din lungimea plasmidei F. Cu exceptia fectorului F, celelalte plasmide conjugative pot include si alte tipuri de gene: pentru rezistenta la antibiotice, toleranta la metale grele, virulenta patogenitate etc.

Studiile asupra procesului de conjugare efectuate la E. coli , au permis stabilirea etapelor acestuia:

Formarea si stabilirea agregatelor de conjugare;

Pregatirea ADN pentru transfer

Transferul ADN conjugativ

Refacerea structurii circulare si dublu catenare a ADN transferat.

In prima etapa are loc sinteza de catre celula donatoare a pililor de sex - structuri specializate, tubulare, localizate la suprafata celulara, alcatuite din molecule de pilina (proteina a carei sinteza este codificata de gene plasmidiale).

A 2-a etapa a conjugarii presupune interventia unei proteine, codificata de genele plasmidiale,  care are rolul de a realiza o crestatura monocatenara la nivelul genei oriT (originea transferului). La nivelul capatului 5' al catenei de ADN crestata, se leaga o proteina specifica, codificata tot de gene plasmidiale de la nivelul regiunii tra. Are loc apoi, transferul catenei crestate, incepand cu capatul 5' , transferul fiind cuplat cu procesul de replicare al plasmidei, conform modelului cercului rotativ. In acest fel, pe masura ce procesul de replicare avanseaza, una dintre catenele vechi (cea crestata) se deplaseaza prin pilul de sex in celula receptoare (Fig. 1).

In acelasi timp, in celula donatoare are loc restabilirea structurii factorului F. la nivel populatiei de bacterii, consecinta transferului factorului F este masculinizarea acesteia, adica se produce generalizarea caracterului F ⁺al celulelor bacteriene.

Fig. 1. Reprezentarea schematica a procesului de conjugare

Un tip special de conjugare este cel realizat intre celulele bacteriene care contin factorul F integrat in cromosom (celule de tip Hfr) si celulele de tip F ^- (Fig. 2). Integrarea factorului F in cromosomul bacterian nu se realizeaza la intamplare , ci la nivelul unor situsuri ce prezinta omologie intre cele doua tipuri de molecule. Celulele rezultate in urma unui asemenea proces de integrare , au primit denumirea de celule de tip Hfr (High frequency of recombination).

Modalitatea specifica de integrare a plasmidei F in cromosomul bacterian, face ca secventa oriT sa fie localizata aproape de una dintre marginile plasmidei linearizate si integrate la capatul acesteia, consecinta fiind transferul specific al ADN monocatenar in celula receptoare.

In a 3-a etapa, in cazul transferului dintre bacteriile F ⁺ si  F ^-, dupa crestarea monocatenara la nivelul secventei OriT, incepe transferul AND monocatenar reprezentat de o scurta secventa din plasmida F si apoi de o copie a AND cromosomal al gazdei (Fig. 2). Cea mai mare parte a plasmidei F ramane la nivelul celuilalt capat al cromosomului, si doar foarte rar este transferata in celula acceptoare. Cantitatea de informatie genetica transferata, proprie celulei donatoare, este direct proportionala cu timpul in care cele doua celule au stat in contact (cu cat contactul este mai lung, cu atat segmentul de ADN transferat va fi mai mare). Astfel, pentru transferul complet al ADN cromosomal la E. coli sunt necesare aproximativ 90-120 minute de contact intre celule, in timp ce transferul plasmidei F din bacteria F ⁺ intr-o bacterie F ^- dureaza 2-3 min.

Procesul de transfer de segmente cromosomale din bacteria donor Hfr in cea acceptoare F ^- este urmat de cele mai multe ori de transformare genetica (fenomen controlat de o serie de enzime sintetizate de gazda) ceea ce inseamna ca portiuni din respectivul segment se integreaza in genomul noii gazde fiind mentinut si transmis constant in generatiile urmatoare.

Procesul de conjugare dintre celulele Hfr si celulele de tip F ^- serveste la realizarea hartilor cromosomale la bacterii , distanta dintre gene (dispuse in ordine pe segmentul transferat) exprimandu-se in unitati de timp (minute).

Transferul de gene cromosomale bacteriene mediat de plasmidele de sex este numit sexductie. In urma conjugarii F ⁺ x F ^- se obtin doar celule de tip F ⁺ , care sunt partial ' diploide ', continand alaturi de genele proprii si gene similare provenite de la bacteria donatoare.

3. Transductia fagica

Transductia fagica este procesul prin care un fragment din cromosomul bacterian este transferat de la o bacterie la alta prin intermediul capsidei (invelisului proteic) anumitor bacteriofagi temperati. Fenomenul a fost descris initial la bacteriofagi specifici unor tulpini de Salmonella typhimurium, iar ulterior el a fost mai bine studiat in cazul fagului λ specific tulpinilor de E. Coli . In functie de structura genetica a fagilor transductori si de mecanismul de formare a materialului genetic al particulri fagice, au fost descrise doua tipuri de transductie fagica: transductie specializata si transductie generalizata.

Bacteiofagii ce realizeaza transductia generalizata produc particule ce contin, in cea mai mare parte, ADN provenit din bacteria gazda (din orice parte a cromosomului) si doar o foarte mica parte genom fagic.

In cazul fagilor ce determina transductia specializata, ei produc particule ce contin atat gene fagice (majoritare) cat si gene cromosomale bacteriene provenite dintr-o anumita regiune a cromosomului bacterian. Cel mai cunoscut bacteriofag ce realizeaza transductie specializata este fagul λ. In forma lui naturala, fagul λ poate psrelua, ca fag transductor, doar scurte secvente de ADN din genomul gazdei in care s-a multiplicat (dupa ce a parcurs ciclul lizogen), dimensiunea acestora fiind limitata de capsida fagica. Secventele pe care le poate prelua fagul λ sunt foarte precise.

Tranductia generalizata este mediata de fagi virulenti precum si de anumiti fagi temperati ai caror genom nu se integreaza la nivelul unor situsuri specifice din cromosomul gazdei (de exemplu fagul P1).