Dozarea proteinelor totale prin metoda biuretului

Dozarea proteinelor totale prin metoda biuretului

Reactia biuretului este comuna tuturor proteinelor, deoarece pune in evidenta prezenta legaturilor peptidice din structura moleculara a acestora. Ea este pozitiva si in cazul oligo si polipeptidelor. Aminoacizii in general nu dau aceasta reactie de culoare, cu exceptia serinei si treoninei.

Cel mai simplu compus care produce aceasta reactie este biuretul, care se obtine prin incalzirea ureei la 180°C cu eliminarea unei molecule de amoniac.

Principiul metodei

Reactia biuretului se bazeaza pe formarea unor compusi de tip chelalic intre legatura peptidica si ionul de Cu²⁺, in mediu alcalin, cu aparitia unei culori violet sau albastra.

Metoda foloseste un singur reactiv, in care hidroxidul de cupru este mentinut in solutie sub forma unui complex format cu tartratul de sodiu si potasiu si stabilizat cu iodura de potasiu.

2(H N - CO - NH → H N - CO - NH - CO - NH + NH

NaOH

H N - CO - NH - CO - NH complex Cu - proteina

CuSO₄ (culoare violet)

Proba

Ser

Tehnica de lucru

Se pregatesc trei eprubete: martor, standard, proba.

Se pipeteaza in eprubete conform tabelului urmator:

Se amesteca si dupa 30 de minute se masoara extinctia probei (E_p) si a standardului (E_s) fata de martor, la lungimea de unda de 546 nm, in cuve de 1 cm.

Calcul

C_p = E_p / E_s × C_s

g proteine / 100ml ser = E_p / E_s × C_s

unde:

C_p = concentratia probei

E_p = extinctia probei

Es = extinctia standardului

Cs = concentratia standardului

Valori normale

nou-nascuti: 5,2 - 9,0 g/100 ml ser

copii sub 3 ani: 5,6 - 8,6 g/100 ml ser

copii peste 3 ani si adulti: 6,6 - 8,6 g/100 ml ser

Variatii patologice

Valori scazute ale proteinelor totale (hipoproteinemii):

malnutritie;

malabsorbtie;

maldigestie;

ciroza hepatica;

sindrom nefrotic;

glomerulonefrita;

insuficienta renala cronica;

ileus mecanic;

hemoragii cronice;

arsuri intinse;

amiloidoza;

peritonita;

hipertiroidie;

hiperhidratare.

Valori crescute ale proteinelor totale (hiperproteinemii):

ciroza hepatica in stadiul compensat;

sarcoidoza;

paraproteinemii;

deshidratare ("pseudohiperproteinemie");

diaree;

stari febrile;

diabet insipid;

tuberculoza.