Metabolismul bacterian

STRUCTURA BIOCHIMICA A CELULEI BACTERIENE

Microorganismele prezinta o structura biochimica complexa, fiind puternic influentata de factorii fizici si chimici din mediu, de varsta culturii bacteriene si starea de spor sau de forma vegetativa. Elementele biochimice participa in diverse etape ample ale metabolismului bacterian, asigurand supravietuirea speciei bacteriene.

1. Metabolismul bacterian: prezinta un numar de caracteristici care explica specificitatea proceselor intracelulare. Astfel, s-a observat ca:

toate procesele fizico-chimice si biologice au loc intr-o singura celula;

exista o mare diversitate metabolica neintalnita la alte organisme vii, extinzandu-se de la cele care isi asigura intreg metabolismul necesar cresterii si multiplicarii, pornind de la substante simple, anorganice, pana la microorganisme obligate la parazitarea celulelor;

prezinta o mare flexibilitate si adaptare;

este un metabolism de mare intensitate ce le asigura o multiplicare rapida (E. Coli in 5 ore inregistreaza o crestere de 100.000 de ori);

diversitatea tipului de metabolism este in raport cu specia si tulpina microbiana, fiind influentat de mediul de viata;

in complexitatea metabolica a lumii bacteriene opereaza o restrictie de ordin genetic.

Metabolismul bacterian are la baza doua procese:

1. catabolismul: reactii metabolice prin care se asigura eliberarea de energie (respiratia bacteriana);

2. anabolismul: reactii metabolice prin care se asigura sinteza componentelor bacteriene.

1. Reactii catabolice (catabolismul - metabolismul energetic)

Metabolismul energetic se desfasoara intr-o singura directie pe cai sau cicluri metabolice insotite de eliberarea de energie. In raport cu sursa si cu acceptorul final de ioni de H₂ (electroni) se pot distinge doua tipuri de eliberare de energie:

1.1. Fermentatia bacteriana

Cuprinde procese de oxido-reducere care realizeaza numai o oxigenare partiala a substratului, donorul si acceptorul de hidrogen (H₂) fiind substante organice sau anorganice.

1.2 Respiratia bacteriana (respiratia oxidativa)

In cadrul acesteia au loc reactii de oxido-reducere in care donorul de hidrogen este o substanta organica, iar acceptorul final de hidrogen este oxigenul atmosferic (O₂), transferul final de electroni facandu-se prin lantul respirator sub controlul enzimatic. Intervin numeroase enzime, dintre care unele specifice bacteriilor. Enzimele cele mai importante sunt:

enzime activatoare de oxigen: citocromoxidaza - citocromi a,b,c (actiunea acestora poate fi testata prin testul oxidazei);

enzime activatoare de hidrogen: dehidrogenaze NAD - NADH;

enzime specifice bacteriilor: flavinproteinele, ubiquinone, enterobactin transferina.

In functie de procesele oxido-reducatoare ce stau la baza respiratiei bacteriene si concentratia de oxigen a mediului, s-au diferentiat 3 tipuri de bacterii:

bacterii strict aerobe

traiesc numai in medii bogat oxigenate; oxigenul molecular liber reprezinta acceptorul final de hidrogen;

prezinta un bogat echipament enzimatic al lantului respirator   (ex. B. Koch);

bacterii anaerobe

nu cresc in prezenta oxigenului atmosferic, nu au enzime de tip catalaza, peroxidaza si citocromoxidaza, acestea fiind distruse de H₂O₂ (produs intermediar de metabolism rezultat in prezenta oxigenului);

acceptorul final de hidrogen este reprezentat de nitriti, carbonati, sulfati (ex. B. botulinic, B. tetanic);

bacterii facultativ anaerobe

au cantitati mici de enzime peroxidaza si se pot adapta la ambele tipuri de respiratie;

donorul de electroni este o substanta organica, iar acceptorul final este o substanta diferita de oxigen (ex. streptococi);

bacterii microaerofile tolereaza cantitati mici de oxigen in mediu, fapt explicat de prezenta unei enzime care inactiveaza superoxidul-superoxiddismutaza.

2. Reactii anabolice (anabolismul - metabolismul de sinteza)

Metabolismul de sinteza reprezinta totalitatea reactiilor metabolice care duc, in final, la cresterea si multiplicarea bacteriilor. Cele mai importante elemente necesare sintezei organice sunt: surse de carbon, azot, fosfor, ioni anorganici, factori de crestere (vitamine, aminoacizi).

2.1. Clasificarea bacteriilor in raport cu metabolismul de sinteza

Se disting trei tipuri metabolice la bacterii: autotrofe, heterotrofe si paratrofe.

Bacterii autotrofe - procura carbonul si azotul din substante anorganice (CO₂ NH₃, nitrati, nitriti); sursa de energie o pot constitui radiatiile din spectrul luminos.

Bacteriile din acest grup: sulfo-bacteriile si nitrobacteriile sintetizeaza materie organica din materie anorganica, participand la circuitul substantelor in natura.

Bacterii heterotrofe - procura  carbonul si azotul din substante organice si folosesc lumina ca sursa de energie (foto-heterotrofe), dar si din compusi organici (chimio-heterotrofe). Bacteriile heterotrofe includ majoritatea speciilor implicate in patologia umana.

Bacteriile paratrofe - microorganisme foarte pretentioase, care nu-si pot sintetiza metaboliti esentiali, care se dezvolta numai intracelular (ex. Richettsiile, Chlamydiile, Mycoplasmele) sau in tesuturi (Treponema pallidum).

3. Cresterea si multiplicarea bacteriilor

In evolutia unei populatii bacteriene cresterea si multiplicarea sunt legate de zestrea ereditara si conditiile de mediu.

3.1. Cresterea bacteriilor este marirea coordonata a structurilor unui organism ca urmare a proceselor predominant anabolice. Cresterea este dependenta de raportul . Orice modificare a acestui raport duce la o limita de crestere ce declanseaza procesul de multiplicare al bacteriilor.

3.2. Multiplicarea bacteriilor - restabileste  raportul si are ca urmare cresterea numarului de germeni ce duce la un maxim de populatie.

Acest proces se realizeaza prin diviziune, rar prin inmugurire (unele bacterii patogene).

3.3. Diviziunea celulara este foarte rapida, 10 - 20 minute, in conditii favorabile de mediu (exceptie face bacilul Koch, la care timpul de generatie este de 18 - 20 ore). Se realizeaza prin diviziune directa: fisiunea binara (sciziparitate). Are loc in doua faze:

separarea si septarea - faza caracteristica prin aparitia unui sept transversal prin interventia membranei citoplasmatice si a mezozomului;

diviziunea nucleara - (semiconservativa) prin autoreplicare, continuata cu segregarea cromozomului.

3. Conditiile de crestere si multiplicare la bacterii sunt reprezentate de anumite necesitati fizico-chimice:

suportul nutritiv

donatori si acceptori de hidrogen (H ): substante organice sau    anorganice (fosfor, sulf, K, Ca²⁺, Mg²⁺, Fe²⁺);

factori de crestere (aminoacizi, baze azotate, vitamine, acizi grasi);

pH-ul : limitele optime de pH 6,0 - 7,0. Exista microorganisme care cultiva optim la un pH mai ridicat, pH 8,5 - 9(vibrionul holeric). Speciile patogene sunt adaptate, in general, la conditii de pH neutru.

temperatura de dezvoltare este apropiata de cea a corpului uman, 37˚C; rata de crestere a culturii este maxima.

Dupa temperatura de crestere se deosebesc:

bacterii mezofile: 30 - 37˚C;

bacterii psichrofile (criofile): 10 - 20˚C (bacteriile implicate  in degradarea alimentelor si medicamentelor - flora frigiderelor);

bacterii termofile: 50 - 95˚C (bacteriile din apele termale sau apele gheizerelor).

tensiunea de oxigenare: oxigenul atmosferic poate constitui un factor benefic cresterii (bacteriile aerobe sau facultativ anaerobe), dar si un element nociv (bacteriile anaerobe lipsite de echipament enzimatic necesar inactivarii radicalului peroxid H₂O₂);

presiunea osmotica: in general, bacteriile pot creste in limite largi ale presiunii osmotice, sunt osmotolerante. Bacteriile patogene cresc preferential in medii izotone, ca mediul intern al organismului gazda.  S-au semnalat si unele microorganisme ce se dezvolta la concentratii mari de NaCl (halofile), dintre speciile patogene: Staphylococcus aureus si Vibrio parahaemolyticus.

3.5. Dinamica multiplicarii bacteriilor in culturi

Dinamica multiplicarii bacteriilor este influentata de mediul de cultura. In conditiile unui volum limitat de mediu, culturile bacteriene sunt discontinue, fapt explicat prin consumarea in timp a substantelor nutritive si producerii de substante toxice.

Organismul uman este un mediu de cultura pentru germeni, dar este in permanenta reinnoit cu substante nutritive, astfel incat culturile bacteriene imbraca un caracter continuu.

In laborator, prin schimbarea continua a compozitiei mediului si barbotarea de oxigen in cultura lichida s-au asigurat conditiile multiplicarii populatiei bacteriene obtinandu-se culturi continue ("agitate"). Aceasta metoda este folosita in producerea de vaccinuri sau toxine bacteriene.

3.6. Dinamica multiplicarii bacteriilor in culturi realizate in laboratorul de microbiologie

In laborator, cultura bacteriilor se realizeaza pe medii artificiale sau culturi celulare.

Dupa insamantarea suspensiei bacteriene pe un mediu de cultura rezulta culturi bacteriene, utilizate in studiul caracterelor morfologice, biochimice, de patogenitate si a sensibilitatii la chimioterapice.

Curba de multiplicare a bacteriilor reprezinta o succesiune de 4 faze:

1. Faza de lag (de adaptare a germenilor la conditiile de mediu)

2. Faza logaritmica (multiplicare logaritmica)

3. Faza stationara (numarul bacteriilor ramane constant)

Faza de declin (multiplicarea bacteriilor scade treptat pana la incetarea completa)

1. Faza de lag (to lag = a intarzia) este faza de ajustare din primele doua ore. Prezinta anumite caracteristici:

numarul de indivizi este aproximativ constant;

reprezinta o faza de acomodare a germenilor la noile conditii de viata;

durata fazei de lag variaza in functie de anumiti factori:

specia bacteriana; astfel, E.coli se adapteaza rapid spre deosebire de genul Mycobacterium, genul Brucella, care reactioneaza foarte incet;

varsta culturii ce serveste la inoculare: o cultura formata din germeni vii si germeni morti cu o perioada de ajustare prelungita in comparatie cu o cultura aflata in faza logaritmica;

temperatura de inoculare: E. coli la 37˚ are o evolutie de 1 - 2 ore, la 20˚ evolueaza foarte incet;

calitatea mediului: saracirea mediului in componente organice sau minerale lungesc perioada de lag. In perioada de lag., bacteriile sunt foarte active metabolic, cresc in dimensiuni, dar nu se divid. Sensibilitatea la agenti antimicrobieni este crescuta. Accelerarea ritmului de crestere determina multiplicarea bacteriilor pana la o valoare caracteristica fazei urmatoare.

2. Faza de multiplicare exponentiala sau logaritmica

Este caracterizata de un ritm maxim si regulat al dezvoltarii bacteriilor, urmare a diviziunii fiecarei celule.

Pentru explicarea procesului maririi numarului de indivizi in cursul fazei exponentiale (logaritmice) s-a luat in consideratie relatia  N = N ₀^Kt, unde:

N = numarul de celule la timpul t;

N₀ = numarul initial de celule din cultura;

K = constanta ce reprezinta rata la care logaritmul natural al numarului de celule creste cu timpul.

Durata fazei de multiplicare logaritmica este in functie de:

epuizarea rezervelor nutritive;

acumularea de produsi toxici rezultati din metabolism;

dezechilibrul de concentratie ionica.

Durata fazei exponentiale este in functie de:

temperatura de incubatie;

compozitia mediului (cat mai aproape de necesitatile speciei);

pH-ul optim;

informatia genetica (caracteristica speciei), ex. bacilul Koch - 27 ore, Escherichia coli - 20 minute.

3. Faza stationara - este o perioada de tranzitie, de incetinire a tuturor proceselor. Ea se caracterizeaza printr-o stabilitate relativa a numarului de germeni dintr-o cultura. Numarul de bacterii vii se suprapune cu numarul total de bacterii. Rata de crestere devine nula, numarul bacteriilor vii ramane constant mai multe ore. Bacteriile din colectii purulente (abcese) se afla in faza stationara.

Faza de declin - se caracterizeaza prin scaderea treptata a numarului total al germenilor. Se produce o crestere a ratei de distrugere a bacteriilor. Descresterea numarului de celule microbiene este proportionala cu timpul. Durata fazei de declin este in functie de specie (Streptococcus pneumoniae - 2-3 zile, E. coli luni de zile). Bacteriile sufera modificari morfologice, aparand forme aberante de involutie.

3.7. Modalitati de dezvoltare a microorganismelor pe medii de cultura

Aprecierea cresterii si multiplicarii bacteriilor pe medii solide sau lichide serveste in diagnosticul bacteriologic, cunoscut fiind faptul ca exista diferente de specie.

Caracterele de cultura pe medii lichide, ce trebuie luate in vedere, sunt:

turbiditatea:  

mediu tulbure (genul Staphylococcus);

mediu limpede cu depozit granular (genul Streptococcus);

formare de val (Vibrio cholerae);

formare de pelicula (familia Enterobacteriaceae);

culoarea: modificarea culorii mediului in verde (Pseudomonas aeruginosa);

mirosul degajat de mediu dupa cresterea bacteriilor poate fi aromat (Pseudomonas aeruginosa) sau fetid (genul Proteus);

Caractere de cultura pe medii solide

Pe mediile solide se apreciaza aspectul coloniilor (colonia = rezultanta unui sir de generatii succesive de germeni proveniti de la acelasi individ):

contur:

regulat (genul Staphylococcus, genul Streptococcus; germeni anaerobi sporulati);

festonat (Corynebacterium diphteriae);

dendritic (Bacillus anthracis);

relief:

bombat mamelonat (genul Staphylococcus, Escherichia coli, Haemophilus influenzae);

plat: formele R (Corynebacterium diphteriae- varianta gravis, Bacillus anthracis);

. suprafata:

lucioasa (stafilococ, streptococ, pneumococ, Bordetella pertussis);

granulara, rugoasa (Corynebacterium diphteriae, Bacillus anthracis, Mycobacterium tuberculosis);

culoare:

nepigmentate (familia Enterobacteriaceae, genul Streptococcus);

pigmentate (genul Staphylococcus, Pseudomonas aeruginosa);

transparente (Shigella, Vibrio cholerae, Bordetella pertussis, Brucella);

opace (stafilococi);

consistenta:

untoasa (Corynebacterium diphteriae);

mucoasa (Klebsiella, Streptococcus pyogenes);

aderenta la mediu:

aderente (genul Salmonella, Pseudomonas aeruginosa);

neaderente (genul Neisseria);

hemoliza

completa tip β (Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus);

incompleta tip α (streptococ);

tip viridians (Streptococcus pneumoniae);

miros:

aromat: Pseudomonas aeruginosa;

fetid: genul Proteus;

Pe baza caracterelor de cultura pe medii solide se pot diferentia trei tipuri de colonii:

colonii S (smooth = neted) sunt colonii cu margini regulate, rotunde, bombate, cu suprafata neteda, usor detasabile de mediu; celulele aflate in aceasta forma au o structura antigenica completa, sunt foarte patogene;

coloniile R (rough = rugos) sunt colonii cu margini neregulate, cu suprafata uscata, rugoasa, aderente de mediu; au structura antigenica degradata, sunt nepatogene sau cu o patogenitate redusa;

Exista si exceptii de la aceasta regula: Corynebacterium diphteriae, Mycobacterium tuberculosis, Bacillus anthracis se dezvolta initial sub forma de colonii R, avand o patogenitate crescuta.

colonii M (mucoase): speciile capsulate se izoleaza sub forma de colonii intens mucoase (genul Klebsiella).

Caractere de cultura pe medii semisolide

Mediile semisolide obtinute prin adaos de 0,5% agar la mediile lichide si repartizate in eprubete turnate in coloana dreapta sau inclinata servesc la studiul mobilitatii bacteriilor si a unor carectere biochimice astfel:

mediul MIU testeaza mobilitatea, producerea de ureaza si indol;

mediul TSI testeaza fermentarea celor trei zaharuri/glucoza, zaharoza sau lactoza, precum si producerea de H₂S si cea de gaz.